Modified chitosans for biomedical applications

Abstract

ABSTRACT: The subject of this thesis is the exploration of the suitability of chitosan and some of its derivatives for some chosen biomedical applications. Chitosan-graft-poly (N-vinyl imidazole), Chitosan-tripolyphosphate and ascorbyl chitosan were synthesized and characterized for specific biomedical applications in line with their chemical functionalities. Chitosan-graft-poly (N-vinyl imidazole), Chi-graft-PNVI, was synthesized by two methods; via an N-protection route and without N-protection to observe the effect of free amine groups on the antibacterial activity. Both chitosan and Chi-graft-PNVI samples demonstrated antibacterial activity against both gram-positive Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis), and against gram-negative Escherichia coli (E. coli). Decreased antibacterial activity was measured with increasing grafting percentage of PNVI. The observed trend can be explained by the fraction of free amine groups present in the samples. PNVI grafting onto chitosan proceeds via both OH-bearing carbons and free amine groups which results in a reduced fraction of free amine groups responsible from the antibacterial effect. When the amine group is protected, grafting proceeds mainly from the hydroxyl bearing carbon atoms. Hence, after deprotection there are higher fraction of free amine groups available for antibacterial activity leading to improved antibacterial activity. New combinations of an aminoglycoside antibiotic, gentamicin with the natural aminopolysaccharide chitosan and Chi-graft-PNVI were investigated as antibacterial agents. It was found that a mixture of gentamicin and Chi-graft-PNVI exhibited a higher antibacterial activity against both S. epidermidis and against E. coli when compared to gentamicin alone. Gentamicin produces an inhibition zone of 8.2±0.2 mm against S. epidermidis when undiluted, while the inhibition zone increases to 25.8±0.7 mm in combination with Chi-graft-PNVI prepared via N-protection. These combinations have a potential to form a basis to new formulations of gentamicin with improved antibacterial activity and might allow usage of decreased doses of the antibiotic. Blood contact properties of chitosan and its derivatives were investigated in detail. Chitosan-TPP bioadsorbents and ascorbyl chitosans were prepared. Nonimprinted and Fe3+ imprinted chitosan TPP gel beads were prepared via physical gel formation. A method based on in-situ crosslinking using ethylene glycol diglycidyl ether, EGDE, was developed to imprint the chitosan-TPP gels with Fe3+ without deteriorating the gel beads. The Fe3+ imprinted and in-situ crosslinked beads proved to be durable and effective adsorbents for Fe3+ in solution. The characteristics of the beads as biomedical iron adsorbents were tested by evaluating their serum iron removal capacities from human blood. The preliminary tests carried out showed that Fe3+ imprinted beads were more effective in decreasing serum iron in human blood, when compared to the nonimprinted beads. The decrease in serum iron level accompanied a parallel decrease in the haemoglobin level. The calcium level was also affected upon contact with the beads. The Fe3+ imprinted beads were less effective than the nonimprinted ones in decreasing the calcium level indicating selectivity towards iron containing species. Blood contact properties of ascorbyl chitosans were investigated by testing for changes in total cholesterol, HDL cholesterol, LDL cholesterol and triglyceride levels in addition to total calcium analysis, complete blood count analysis and prothrombin time determination upon contact in human blood with ascorbyl chitosans. The lipid lowering activity increased with ascorbyl substitution. The inherent non specific adsorption capability of chitosan due to its chelating power with several different functional groups was exhibited by ascorbyl chitosans as well. This behaviour was exemplified in a simultaneous decrease in the total iron values of the volunteers together with lower lipid levels. Furthermore, ascorbyl chitosans were observed to have less hemocompatibility but increased anticoagulant activity when compared to chitosan alone. Ascorbyl chitosans performed better blood contact properties as biomaterials compared to ascorbic acid alone but poorer when compared to chitosan alone. In summary, the suitability of chitosan-based materials was examined in different biomedical domains. Our results highlight the importance of this particular polymer in biotechnology and biomedical applications. Keywords: Chitosan, N-vinyl imidazole, antibacterial activity, tripolyphosphate, Fe3+ adsorption, imprinting, blood contact chitosan, cholesterol lowering activity, vitamin C (ascorbic acid), biomedical applications.

………………………………………………………………………………………………………………………… ÖZ: Bu tezde kitosan ve türevlerinin biyomedikal uygulamalarda uygulanabilirliği incelendi. Kitosan-aşı-poli (N-vinil imidazol), kitosan-tripolifosfat ve askorbil kitosanlar sentezlenip kimyasal işlevleri doğrultusunda özel biyomedikal uygulamalarda kullanımı ile ilgili olarak karaterize edilmeye çalışıldı. Kitosan-aşı-poli (N-vinil imidazol), serbest aminlerin antibakteriyel aktiviteye etkisini anlamak için serbest amin gruplarını korumalı ve korumasız olmak üzere iki farklı metodla sentezlendi. Hem kitosanın hem de amin korumalı olarak sentezlenen kitosan- aşı-poli(N-vinil imidazol) örnekleri gram-pozitif Stapilokokkus epidermidis (S. epidermidis), ve gram-negatif Escherichia coli (E. coli) ye karşın antibakteriyal etki gösterdiği saptandı. Aşılanan PNVI yüzdesi arttıkça antibakterial aktivitede azalma olduğu gözlendi. Gözlenen bu eğilim örneklerdeki mevcut serbest amin grupları ile açıklanabilir. PNVI nin kitosana aşılanması antibakterial aktivite için gerekli fonksiyonel gruplardan OH taşıyan karbon atomu ve serbest amin grupları aracılığı ile gerçekleşir, bu durum antibakterial aktiviteyi engeller. Ancak amin grubunun korumalı olması halinde aşılama, kitosanın özellikle OH taşıyan karbon atomu aracılığı ile gerçekleşir. Aşılama sonrası koruma bozulduğunda ortaya çıkan serbest amin gruplarının antibakterial aktivitede etkin rol aldığı anlaşıldı. Aminoglikozid antibitotiklerinden biri olan gentamisin ile doğal aminopolisakkaritlerden biri olan kitosan ve kitosan türevi, kitosan-aşı-poli (N-vinil imidazol), kombinasyonlarının antibakteriyel etkileri incelendi. Gentamisinin amin korumalı metodla sentezlenen kitosan-aşı-poli (N-vinil imidazol) ile karışımının, gentamisinin yalnız başına S. epidermidis ve E. coli’ ye karşı gösterdiği antibakteriyal aktiviteden daha etkin antibakteriyal etkisi olduğu bulundu. S. epidermidise karşın gentamisin yalnız başına 8.2±0.2 mm inhibasyon zonu oluştururken, gentamisinin amin korumalı metodla sentezlenen kitosan-aşı-poli (N-vinil imidazol) ile karışımının inhibaston zonunu 25.8±0.7 mm ye artırdığı ölçüldü. Böyle kombinasyonların iyileştirilmiş antibakteriyal aktivite ve düşük dozda gentamisin kullanımını sağayacak potansiyel gentamisin türevleri olarak antibiyotik kullanımında aday olabilecekleri düşünüldü. Kitosan ve kitosan içerikli materyallerin kanla etkileşim özellikleri detaylı olarak incelenmeye çalışıldı. Bu amaçla kitosan-tripolifosfat (TPP) jel boncuklar ve askobil kitosan hazırlandı. Öncelikle, Fe3+ baskılanmış ve baskılanmamış kitosan-TPP jel boncuklar oluşturuldu. Baskılama sonucunda yapıda bozunmaya yol açmayan etilen glikol diglisidil eter, EGDE, çapraz baglayıcısı kullanılarak in-situ çapraz bağlama ile yeni bir Fe3+ baskılama yöntemi geliştirildi. Fe3+ baskılanmış in-situ çapraz bağlanmış jel boncuklar hem daha kararlı hem de Fe3+ adsorpsiyonunda daha etkin olduğu anlaşıldı. Sentezlenen jel boncukların potansiyel biyomedikal demir adsorbanı olarak kullanılabilirliği ile ilgili özellikleri insan kanından serum demiri giderme kapasitesini değerlendirmek ile test edildi.Yapılan ön çalışmalar Fe3+ baskılanmış kitosan-TPP jel boncukların baskılanmamış kitosan-TPP jel boncuklara göre insan kanında serum demirini azaltmada daha etkili olduğu bulundu. Serum demiri düzeyindeki azalma hemoglobin düzeyindeki azalma ile paralel olduğu tespit edildi. Fe3+ baskılanmış kitosan-TPP jel boncukların baskılanmamış kitosan-TPP jel boncukların insan kanı ile etkileşiminin kalsiyum düzeyinde de değişmeye neden olduğu saptandı. Fe3+ baskılanmış kitosan-TPP jel boncuklar kalsiyum düzeyini azaltmada baskılanmamış kitosan-TPP jel boncuklara kıyasla daha az etkili olmuştur. Kanla etkileştirilen askorbil kitosanların, toplam kolesterol, HDL kolesterol, LDL kolesterol, trigliserit ve toplam kalsiyum düzeyine etkisi incelendi. Tam kan sayımı analizi ile ve protrombin zamanına etkisi ile kanla uyumluluğu incelendi. Lipid seviyesini düşürme etkisi artan askorbil grubu ile daha fazla olduğu bulundu. Farklı birkaç fonksiyonel grubun varlığından kaynaklanan non spesifik adsorpsiyon özelliği ile kitosanın şelasyon kapasitesi askorbil kitosan örneklerinde de korundu. Bu davranış, lipid düzeyleri ile birlikte toplam demir seviyelerindede eşzamanlı olarak azalma ile örneklendirilmiştir. Ayrıca askorbil kitosanların kanla uyumluluğunun kitosana kıyasla daha az olduğu ve antikoagülan aktivitenin kitosana kıyasla askorbil kitosan ile arttığı görüldü. Askorbik asite kıyasla askorbil kitosanların kanla uyumluluğunun iyileştirildiği bulundu. Özetle, farklı biyomedikal alanlarda kitosan-esaslı malzemelerin uygunluğu incelendi. Sonuçlarımızda biyoteknoloji ve biyomedikal uygulamalarda bu özel polimerin önemi vurgulandı. Anahtar Kelimeler: Kitosan, N-vinil imidazol, antibakteriyal aktivite, tripolifosfat, Fe3+ adsorpsiyonu, baskılama, kitosan-kan etkileşimi, kolesterol düşürme aktivitesi, vitamin C, biyomedikal uygulamalar.